Clostridium botulinum

Clostridium botulinum

Autores: Rafael A. Fernández y Alejandro Silvestre

Introducción

El género Clostridium comprende bacilos Gram positivos, la mayoría móviles, anaerobios obligados, formadores de en­dosporas. C. botulinum y otras especies, son productores de distintos serotipos de toxina botulínica, poderosa neurotoxina causante del botulismo que afecta al hombre y algunos animales. Fue reconocido como entidad clínica en 1793 en Alemania y recibió ese nombre en 1870, término derivado de la palabra latina Abotulus@ que significa embutido en general. Las neurotoxinas botulínicas son proteínas extremadamente tóxicas con una DL50 para el ratón de 10-8 mg-1 kg-1 (Cai S. et al., 1999).

Se reconocen tres formas clínico-epidemiológicas de botulismo: (1) por alimentos o intoxi­cación clásica, la más antigua pero poco frecuente, (2) por herida, la más rara y (3) del lactante, en niños menores de 1 año de edad, la más recientemente reconocida y más frecuente. Una cuarta forma, de clasifi­cación indeterminada o críptico, fue propuesta para casos esporádicos que afectan a mayores de un año de edad sin antecedentes de herida o ingesta de alimento sospechoso, es el equivalente del botulismo del lactante en el adulto y parece estar asociado a una función gastrointestinal anormal (Merson, H.M., and Dowell, B.R., 1973; California Morbidity NE 34, Supplement, 1976).

El sitio de producción de toxina es diferente en cada una de las formas pero comparten el signo común de parálisis muscular fláccida y muerte por asfixia. La toxina, luego de la fijación presináptica en la placa mioneural bloquea la liberación de acetilcolina. La letalidad puede ser alta si no se realizan precozmente el diagnóstico y el tratamiento adecuados, principalmente en el botulismo por alimentos y por herida.

Las características clínicas y epidemiológicas generalmente son típicas como para establecer el diagnóstico presuntivo y la confirmación por el laboratorio se realiza mediante: (1) detección y tipificación de toxina botulínica en muestras de suero, contenido intestinal, vómitos, alimentos, muestra de herida y material de necropsia y/o (2) investigación de C. botulinum en materia fecal, vómitos, alimentos y muestra de herida.

Por su especificidad antigénica se di­fe­rencian siete tipos de neurotoxinas: A, B, C, D, E, F y G y cuatro subtipos: Ab, Af, Ba y Bf, con efectos similares en un huésped afectado.

Actualmente está reconocido que la produc­ción de toxina no es un parámetro adecuado para basar la identificación de espe­cies. Se ha demostrado que, además de C. botulinum, ­­otros clostridia como C. baratii y C. butiricum, aislados de heces de casos de ­botulismo del lactante, producían toxinas botulínicas tipos F y E respec­tivamente habiendo siendo implicados como causan­tes de la enfermedad (Fernández R. A. y col., 1995); y además, estu­dios ge­néticos demos­traron que los organismos aislados es­taban estrechamente rela­cio­nados a las cepas tipos de las especies a las cuales se pa­recían fenotípica­mente. Se con­cluyó, por lo tanto, que la cla­sificación por la toxigenicidad, como se realiza para la heterogénea espe­cie C. botulinum, se tornaba obsoleta, y más aún a medida que se obtie­nen nuevas evidencias científicas.

Así, Suen y col. propusieron en 1988 una nueva especie, Clostridium argentinense (ar.gen.tin.en’se. N.L. neut. adj. argentinense: proveniente de Argentina) para la primera cepa aislada de C. botulinum productora de toxina botulínica tipo G. Nom­bre elegido debido a que fue aisla­da en Argentina (Giménez D. F., and Ciccarelli A. S., 1970.

No obstante, sobre la base del resultado de la prueba de neutralización, generalmente se sigue haciendo extensiva la denominación de determinado serotipo de toxina a la cepa que la produce.

Por otro lado, no siempre una cepa produce un único tipo de toxina. Una excepción corresponde a los subtipos que incluyen cepas cuya toxina está integrada por una fracción mayor y una menor de distinto tipo. Actualmente se reconocen cuatro: Ab, Af, Ba y Bf (Giménez D. F. and Giménez J. A., 1993). El primero descrito, el Af (Giménez, D.F. and Ciccarelli, A.S. (1967), fue res­ponsable de un caso fatal de botulismo por alimentos (Fernández, R.A. y col.­, 1986). Otra excepción la constituyen las cepas C y D: las toxinas de los tipos C y D comparten mutuamente fracciones antigénicas, evidenciadas por la capacidad de neutralización cruzada de ambas antitoxinas a bajos niveles de prueba. Estos dos tipos sólo se diferencian mediante el estudio cuantitativo de los respectivos consumos recíprocos de antitoxina. Se acepta que la toxina tipo C está integrada por las fracciones C1 y C2 (no neurotoxina) y D. Algo similar sucede con la toxina tipo D.

Cabe destacar que ­como la correcta tipifica­ción debe re­ali­zarse a través de pruebas serológicas cuantitativas a altas dosis de toxina, la identificación de un subtipo es prácticamente imposible con ­muestras de especímenes clínicos (espe­cialmente suero sanguíneo), ya que la fracción tóxica minori­taria puede pasar inadvertida y, en tal caso, un tratamiento seroterápico podría resultar ineficaz y llevar al paciente a la muerte (Fernández, R.A. y col.­, 1986; Giménez D. F. and Giménez J. A., 1993).

El principal reservorio de C. botulinum es el suelo. Para evaluar correctamente los riesgos de incidencia del botulismo en sus distintas formas patogénicas, es necesario conocer la distribución de los diferentes serotipos en la naturaleza. Su presencia en el suelo genera una fuente inagotable de contaminación y la especificidad serológica de los distintos tipos antigénicos genera problemas en la tipificación, con implicancia directa en el diagnóstico y tratamiento. Por ello, es indispensable conocer los serotipos prevalentes en nuestro medio para contar con los correspondientes sueros antitóxicos específicos para uso diagnóstico y terapéutico.

Epidemiología

Las esporas, resisten­tes a la desecación y el calor, están ampliamente distribuidas en la naturaleza, se encuentran en el suelo (su hábitat más fre­cuen­te), polvo, barros, sedimentos de lagunas y océanos y en la su­perficie de vegetales, por lo que no resulta difícil su ac­ceso a los alimentos, al apa­rato digestivo y a las heridas. El suelo resulta así, la principal fuente de contaminación de gran variedad de alimentos y fuente de infección en el botulismo por herida y del lactante.

Los tipos A, B, E y a veces el F, están relacionados al botulismo humano; los tipos C y D afectan principalmente a las aves y mamíferos. El tipo G, aislado en Argentina en 1969 por Giménez y Ciccarelli en muestras de suelo de un maizal en Mendoza, hasta el presente no ha estado implicado en brotes de botulismo, pero se ha aislado en Suiza de muestras de autopsia de humanos cuya causa de muerte fue desconocida.

C. botulinum tiene una distribución geográfica desigual pero amplia en todo el mundo. Con excepción de Argentina, los países que registran el mayor número de casos están localizados al norte del trópico de Cáncer. El tipo A es el causante más común de brotes en Estados Unidos, China y Argentina y está asociado principalmente al consumo de vegetales, mientras que en Europa prevalece el tipo B y a menudo están involucrados productos cárneos. El tipo E predomina en regiones frías del hemisferio norte, Japón, Alaska, Canadá y Rusia, se ha hallado en sedimentos lacustres y costas marinas y la intoxicación se relaciona con el consumo de pescado y derivados, ahumados y en conserva. Los estudios de distribución de C. botulinum toxigénico en Argentina sobre un total de 1.453 muestras, demuestran dos hechos importantes: alta prevalencia en el suelo (27,2%) y multiplicidad de serotipos (A, B, F, Af y G), ambos de significativa consideración epidemiológica.

El botulimo por alimentos, forma más conocida de botulismo, resulta de la ingestión de alimentos que contienen la toxina. Cuando los alimentos ­conta­minados (1) se elabo­ran en forma inadecuada: tratamiento térmico insuficiente (inferior a 120 1C por 10 min o 100 1C por 8 h), pH mayor de 4,5 o actividad acuosa mayor de 0,97 y (2) no son conservados a tem­peratura por debajo de 12 1C para los tipos A y B y 4 1C para el tipo E, pueden permitir la germinación de las esporas, crecimiento y producción de toxina. Si es ingerido,­ la toxina se absorbe en el intestino y por vía sanguínea llega y se fija a la placa mioneural.

Se incluyen todos los alimentos envasados vegetales, cárneos o mixtos y algunos no envasados como pueden ser jamón, queso y embutidos. Se exceptúan, en principio, los alimentos envasados preservados en vinagre (pH menor a 4,5) o salmueras con concentración de NaCl superior al 7%, los congelados, deshidratados, dulces y alimentos naturalmente ácidos.

Desde 1951 hasta 1996 se han registrado mas de 12.000 casos de botulismo por alimentos en todo el mundo y están asociados con tres serotipos principalmente: A 34%, B 52% y E 12%, y sólo dos casos estuvieron asociados al tipo F (Montecucco C. et al., 1996). Cabe destacar que en Argentina este serotipo estuvo implicado en dos brotes: en 1981 se produjo el primero simultáneamente con el tipo A (A+F) por consumo de escabeche de pescado, aislándose ambas cepas del alimento y heces del único caso, y el segundo se produjo en 1991 por consumo de pepinillos en salmuera.

En el Cuadro 1 se muestra la relación entre los tipos serológicos de C. botulinum, principales especies afectadas, fuentes implicadas y distribución geográfica.

La frecuencia de esta enfermedad es variable y está vinculada a los hábitos alimentarios de cada país. La letalidad se relaciona sobre todo con el serotipo de toxina y el porcentaje varía dependiendo de diversos factores.

Afortunadamente, la aplicación de medidas profilácticas en la elaboración y preparación de alimentos, en especial las conservas caseras, ha reducido la incidencia de botulismo por alimentos y hoy es una enfermedad mundialmente poco frecuente y con tendencia a disminuir, pero es siempre objeto de atención por su elevado índice de letalidad.

Entre 1922 y 1999 se registraron en Argentina 79 brotes con 269 casos, de los cuales 112 fallecieron (41,6%), letalidad que disminuyó progresivamente hasta 17,1% en la última década (1990-1999). En cuanto al alimento implicado, en 16 de los 79 brotes (20,3%) se desconoce su origen, de los 63 restantes, 35 (55,6%) fueron de origen vegetal, 9 (14,3%) de origen animal y 19 (30,2%) de origen mixto. Según la elaboración, la distribución de los brotes resultó: casera 53 (84,1%), industrial 10 (15,9%). En cuanto a los serotipos de toxina implicados, prevaleció el tipo A y además, se registraron 2 brotes por tipo E, 1 por F, 1 por A+F, 1 por B y 1 por el subtipo Af.

En cuanto al botulismo del lactante, fue descrito en 1976 en EE.UU. (California Morbidity NE 34, 1976) y en Argentina en 1982. Hoy, debe ser la forma clínica más frecuente y debido al elevado número de niños de 2 a 25 semanas de edad afectados, a la dificultad en el diagnóstico diferen­cial con otras patologías neurológicas y a su compromiso con el síndrome de muerte súbita, debe ser consi­derada, también, la forma más importante del botulismo. En nuestro país se registraron 180 casos hasta 1999.

La transmisión, aún no totalmente aclarada, es objeto de intensos estudios. Las espo­ras llegan al ­intestino de los lactantes por vía digestiva a través de cualquier elemento contaminado con suelo o polvo ambiental, o por vía aérea con posterior de­glución con las secreciones. En condiciones normales, la microbiota intestinal contribuye a impedir la multiplicación de las esporas. Cuando coloniza, la toxina generada in situ es in­corporada a la circulación.

La llegada de las esporas al intestino se ha intentado explicar por el consumo de alimentos, pero sólo se identificaron esporas en miel y jarabe de maíz, no existiendo en muchos casos antecedentes de ingesta. En estudios realizados en distintos centros de Argentina se analizaron 227 muestras de miel detectándose esporas de C. botulinum toxigénico en 8 (3,5%), identificándose en 4 el serotipo A y en 1 el Af, en 3 no se identificó el serotipo (Fernández, R. A. and Ciccarelli, A. S., 1999; Fernández, R. A. Et al., 1999; Centorbi, H. J. et al., 1999; Monetto, A. M. et al., 1999; Rosetti, F., et al, 1999). De las 8 muestras positivas, sólo 4 estuvieron asociadas con casos de botulismo del lactante.

Otra fuente potencial de esporos pueden ser las infusiones de hierbas medicinales que se administran con cierta frecuencia a lactantes para tratar diferentes condiciones (Satorres, S. E.et al., 1999). En nueve casos diagnosticados en la ciudad de San Luis, Argentina entre junio de 1995 y octubre de 1997, a siete les habían suministrado infusiones de hierbas. En un estudio de 100 muestras de plantas medicinales en nuestro país, en 4 se identificó C. botulinum tipo A (poleo, yerba del pollo, anís y sen).

En Argentina se produjeron 180 casos entre 1982 y 1999 (18 años) (Fernández, R. A., et al. 1999; Puig de Centorbi, O., et al., 1999; Rosetti, F., et al., 1999). La distribución por provincia fue: Mendoza 54 (30,0%), Buenos Aires 52 (28,9%), Neuquén 22 (12,2%), San Luis 19 (10,6%), Río Negro 7 (3,9%), Chubut 6 (3,3%), Córdoba 5 (2,8%), La Pampa 5 (2,8%), San Juan 4 (2,2%), Tucumán 1 (0,6%), Santa Fe 1 (0,6%), Salta 1 (0,6%), Santiago del Estero 1 (0,6%) y en Misiones y Tierra del Fuego un caso en cada una no disponiendo de la confirmación definitiva. La edad de los lactantes varió, en 170 casos en que se registró, entre 2 y 48 semanas, con el 50,0% (85/170) entre 2 y 12 semanas y el 94,7% (161/170) entre 2 y 24 semanas. De 127 (70,6%) pacientes en que se registró el sexo, 56 (44,1%) fueron varones y 71 (55,9%) mujeres. Considerando la estación del año, 44/178 (24,7%) ocurrieron en invierno, 57/178 (32,0%) en primavera, 48/178 (27,0%) en verano y 29/178 (16,3%)en otoño. La mayoría de los pacientes residían en áreas suburbanas o rurales. En todos los casos se identificó el tipo A, consistente con la predominancia de este tipo en suelos de Argentina.

El botulismo por herida es una enfermedad rara. En EE.UU. fue descrito por primera vez en 1943 y hasta 1990 sólo se habían reportado 47 casos. Sin embargo, en sólo 11 años (1986-96) se produjeron en ese país 79 casos, con 26 entre 1986 y 1993 (3,3 casos/año) y 53 entre 1994 y 1996 (17,7 casos/año) (Cuadro 2 y Gráfico 1). Este notable incremento se debe al aumento de la patología en adictos a drogas por vía endovenosa. En argentina, hasta 1999 se han denunciado 3 casos, sólo 1 confirmado debidamente por pruebas de laboratorio en 1995 en Mendoza (identificación de toxina en material de la herida y suero sanguíneo y aislamiento de C. botulinum de la herida) (Blaustein, A. y col., 1997).

Se puede concluir que la alta prevalencia de C. botulinum toxigénico en suelos de Argentina implica un riesgo permanente para la salud humana debido a la probable contaminación de los alimentos envasados. No obstante, en los últimos años se observa una tendencia a disminuir la incidencia del botulismo por alimentos, tal vez debido a un mayor conocimiento popular de esta patología, a las precauciones que se toman en la preparación de los alimentos y a la intensificación de la vigilancia bromatológica. En el caso del lactante, aunque puede considerarse que la inhalación y posterior deglución de las esporas con el polvo ambiental es posiblemente la principal forma de transmisión, es aconsejable que los niños menores de un año no consuman miel evitando así un factor de riesgo.

Por el incremento notable del botulismo por herida en EE.UU. y la elevada frecuencia mundial que se sospecha del botulismo del lactante, es que hoy debemos considerar al botulismo como una enfermedad legítimamente reemergente.

Debe destacarse también, la importancia de la utilización de la toxina botulínica (1) en la guerra biológica (1 g de toxina es potencialmente letal para 1,5 millones de personas y aerosolizada por vía aeronáutica puede diseminarse más del 60% de la dosis a la población blanco) (Shapiro R. L., 1997) y (2) en terapéutica en diversas distonías musculares, hiperhidrosis e incluso en cosmética dermatológica.

Población de riesgo

Cualquier persona con alimentación mixta es susceptible de padecer botulismo por alimentos. El botulismo por herida ocurre con mayor frecuencia en varones jóvenes, de la primavera al otoño, ­con una distri­bución similar al tétanos antes del uso del toxoi­de, lo que podría reflejar su mayor actividad al aire libre y por lo tanto mayor exposición al suelo. En el botulismo del lactante se consideran en riesgo los lactantes menores de un año.

Descripción y Clasificación del agente (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1986)

La especie C. botulinum incluye siete tipos (A, B, C, D, E, F y G) y cuatro subtipos (Ab, Af, Ba y Bf) (Giménez, D. F. and Giménez, J. A., 1993) que se di­fe­rencian por la especificidad antigénica de sus neurotoxinas­­. Aunque las toxinas son serológicamente diferen­tes, los distintos serotipos producen efectos similares en el huésped afectado. Al­gunas toxinas, particu­larmente las de cepas no proteolíticas, re­quieren activación con tripsina para manifestar su actividad en las pruebas de laboratorio.

Además de las exotoxinas, C. botulinum posee antígenos somáticos, flagelares y de esporas, que se pueden demostrar por técnicas de aglutinación, precipitación, inmunofluorescencia y otras. Estos antígenos dan pruebas cruzadas entre las cepas de los distintos grupos, con cepas no toxigénicas e incluso con otras especies de clostridios, por lo que no son de utilidad con propósitos de identificación.

Holdeman y Brooks (1970) dividieron la especie en tres grupos metabólicos y las cepas de C. botulinum tipo G, des­crito en Mendoza por Giménez y Ciccarelli (1970), metabólicamente dife­rentes, fueron colocadas por Smith y Hobbs (1974) en un grupo aparte. Estos grupos, que además incluyen otras espe­cies feno­típicamente similares, son:

I Cepas de tipo A, cepas proteolíticas de tipos B y F y C. sporogenes.

II Cepas de tipo E y cepas sacarolíticas, no proteolíticas de tipos B y F.

III Cepas de tipos C y D y C. novyi tipo A.

IV Cepas de tipo G y C. subterminale.

Debido a las claras diferencias exhibidas por las cepas en su acti­vidad metabólica en los cuatro grupos y la pér­dida de la homología de ADN entre los grupos, C. botulinum podría quizá ser dividido en cuatro especies diferentes. Sin em­bargo, debido a la acción única y similar de las toxinas producidas por to­das las cepas y para facilitar la comuni­cación entre las pro­fe­siones microbiológica y médica, son mantenidos en una sola especie. El género Clostridium comprende un amplio rango de microorganismos y se han propuesto cinco nuevos géneros y once nuevas especies en base a la secuencia del ADN para la porción 16 S del ARN ribosómico (Young D. I. et al., 1999).

Descripción de los grupos

Son bacilos rectos o ligeramente curvos, con los extremos redondeados, de 3 a 10 μm de largo por 1 a 2 μm de ancho (Foto 2a). Gram positivos, aunque se tornan Gram negativos en cultivos viejos; se presentan aislados y a veces en pares o en cortas cadenas. Son móviles por flagelos pritricos; no poseen cápsula. Las esporas son ovales subterminales, en general deforman el soma bacteriano. Su formación depende de condiciones adecuadas de temperatura, pH, anaerobiosis nutrientes y otras variables para los diferentes tipos. Las esporas del grupo I son mucho más termorresistentes que las del grupo II (D100= 25 min y 0,1 min respectivamente). Además, el rango de temperatura para a germinación es de 10-48 °C para las del grupo I y 3,3 a 45 °C para las del grupo II; el pH mínimo inhibitorio para la germinación de esporas del grupo I es de 4,6, estipulándose 4,5 como pH máximo en alimentos conservados para el control de C. botulinum.

No son microorganismos exigentes. Mesófilos, aunque algunas cepas del grupo II pueden crecer a 3 °C. El pH óptimo es de 6,6 a 7,2 y crecen en anaerobiosis. En agar sangre muestran beta hemólisis alrededor de las colonias. En medios con yema de huevo se observa la producción de lipasa (halo iridiscente) excepto con las cepas del tipo G. Las colonias varían de 3 a 8 mm de diámetro, con bordes irregulares y centro opaco.

En medios con carne o huevo, algunas cepas muestran actividad proteolítica. Frente a los hidratos de carbono la actividad sacarolítica varia de un tipo a otro. La identificación de cepas se puede realizar por el análisis de los productos metabólicos finales (principalmente ácidos grasos), mediante cromatografía en fase gaseosa. No producen indol y la producción de H2S es variable.

I. Tipo A y cepas proteolíticas de tipos B y F. La temperatura óptima de desarrollo es de 30-40EC. Al­gu­nas cepas crecen bien a 25EC y pocas a 45EC. El desarrollo es inhibi­do por cloruro de sodio 6,5%, bilis 20% y a pH 8,5. No se ha comprobado la mediación de la producción de toxina por fagos en estas cepas. Aislados comúnmente del suelo y sedimentos marinos y la­custres. También han sido encontrados en intestino de anima­les, aves y peces y en alimentos (particularmente en conservas de vegetales, carnes y pescados procesadas inadecuadamente). Los tipos aislados fueron coincidentes con los presentes en el suelo y sedimentos del área. Los ti­pos A y B son los más frecuente­mente aislados en brotes de into­xicación ali­mentaria y casos de botulismo del lactante y por herida. Poseen una alta homología ADN-ADN con C. sporogenes y no pueden ser diferenciados metabólica ni quí­micamente, pero sí por la prueba de neutralización de to­xina en ratón.

II. Tipo E y cepas no proteolíticas de los tipos B y F. La temperatura óptima de desarrollo oscila en 25-37EC. Crece poco o nada a 45EC. El desarrollo es estimulado por la presencia de un carbohidrato fermentecible y es inhibido por cloruro de sodio 6,5%, bilis 20%, o a pH 8,5. Aislados del suelo, sedimentos marinos y lacustres, ali­mentos, peces, aves y mamíferos.

III. Tipo C y Tipo D. La temperatura óptima de desarrollo es 30-37EC; la ma­yo­ría de las cepas crecen bien a 45EC, y pobremente o nada a 25EC. El desarrollo es estimulado por la presencia de un car­bohidrato fermentecible, pero es inhibido por cloruro de sodio 6,5%, bilis 20% o a pH de 8,5. Los sobrenadantes de los cultivos son tóxicos para el ratón; los de cepas de tipo C son tóxicos para aves galli­ná­ceas; las cepas son patógenas para animales de laborato­rio. La producción de toxina por C. botulinum tipo C y tipo D está mediada por fagos, y el tipo de toxina que se produce esta determinado por el fago espe­cífico. C. botulinum tipo C puede ser curado del fago tipo C y de su toxina y luego convertido con otro fago en C. novyi tipo A. Aislados de heces y carcasas de animales y aves, y del suelo, barro lacustre y vegetales en descomposición.

IV. Tipo G. Actualmente denominado C. argentinense. La temperatura óptima de desarrollo es 30-37EC. Los cul­tivos desarrollan casi tan bien a 25EC como a 45EC. El desa­rrollo es inhibido por cloruro de sodio 6,5% y por bilis 20%. La cepa de referencia es inhibida por tres cepas de C. perfringens aisladas del suelo. El sobrenadante de los cultivos es tóxico para el ra­tón. Los monos, pollos, cobayos y ratones son susceptibles a la toxina; las ovejas y perros son resistentes. Aislado del suelo por Giménez y Ciccarelli (1970) en Ar­gentina y de muestras de autopsias humanas por Sonnabend y col. (1981). A diferencia de los otros tipos de C. botulinum, las ce­pas de tipo G no producen lipasa en agar yema de huevo. Deben ser diferenciadas de cepas de C. subterminale, a las que son muy semejantes fenotípicamente, por su toxicidad en ratón.

Neurotoxinas botulínicas (Montecucco C. et al., 1996)

Se sintetizan durante la fase de crecimiento, se acumulan en el citoplasma y se liberan principalmente luego de la lisis celular. Son proteínas que se inactivan por el calor (80 °C durante 10 min), por los precipitantes corrientes de proteínas y por los metales pesados; reaccionan con el formaldehído dando un producto no tóxico que mantiene su capacidad altamente antigénica (toxoide o anatoxina). La determinación se su toxicidad se realiza por inoculación intraperitoneal al ratón.

Las neurotoxinas botulínicas son producidas como cadenas polipeptídicas simples, inactivas, de 150 kDa. Son liberadas por autolisis bacteriana como complejos con otras proteínas no tóxicas, complejos que se denominan toxinas progenitoras. Se han identificado tres formas de estos complejos: tamaño extragrande (19S, -900 kDa), grande (16S, 500 kDa) y medio (12S, 300 kDa). La toxina se disocia del complejo a los valores de pH moderadamente alcalinos del intestino. Las toxinas progenitoras son más estables a la proteólisis que la toxina purificada y a la desnaturalización inducida por la temperatura, solventes o bajo pH.

Las proteínas complejantes no son tóxicas pero tienen acción hemaglutinante. el complejo es estable a pH ácido, pero a valores por encima de pH 6,1 se disocia en sus dos componentes. Así, cuando la toxina ingresa por vía oral, el pH estomacal favorece su estabilidad; además la fracción atóxica la protege de la acción de las enzimas gástricas. Cuando alcanza el duodeno y yeyuno, el pH local favorece la disociación, conforme atraviesa la pared intestinal se desprende la fracción atóxica y la molécula tóxica (150 kDa) alcanza la linfa y torrente sanguíneo. Cai S. y col (1999) aportaron datos que sugieren que las proteínas complejantes no tóxicas juegan un papel accesorio en la función neurotóxica En contraste con una función limitada sólo a una acción protectora en el tracto gastrointestinal y el medio externo, aseguran que la actividad enzimática del complejo es varias veces más elevada que la de las toxina A purificada.

Las dosis letales orales para humanos se han estimado en un rango de aproximadamente 5 x 103 DL50 ratón para las toxinas del grupo I (A y B) y de 1 x 105 DL50 ratón para las toxinas B y E del grupo II. La letalidad de las toxinas puede aumentar en presencia de tripsina y otras enzimas proteolíticas, siendo las del grupo II (B, E y F) particularmente susceptibles de activación, aumentando hasta 100 veces o más su potencia luego del tratamiento.

Diferentes proteinasas clostridiales y tisulares pueden hidrolizar la cadena simple de la molécula de toxina (150 kDa) en un anillo peptídico expuesto entre la cadena pesada y la liviana, generando una doble cadena. La cadena pesada (100 kDa) y la liviana (50kDa) permanecen unidas por un puente disulfuro. Las evidencias disponibles actualmente indican que la toxina consta de tres dominios de 50 kDa, estructura que se relaciona con cuatro pasos diferentes en el mecanismo de intoxicación celular. Ellos son: (1) unión a la célula neuronal por el extremo C terminal de la cadena pesada, (2) internalización, (3) translocación de la cadena liviana a través de la membrana con reducción del puente disulfuro y liberación en el citosol, paso en el que está involucrado el extremo N terminal de la cadena pesada; y (4) actividad catalítica intracelular, exhibida por la cadena liviana.

Luego de la difusión en los líquidos corporales, las toxinas se unen selectivamente a componentes presinápticos de la unión neuromuscular aún no bien identificados. Aparentemente los distintos tipos se unirían a diferentes receptores y la variabilidad en la respuesta de pacientes a la toxina A podría atribuirse a diferencias en el número y/o exposición de los receptores para las neurotoxinas. Mientras la toxina unida a la membrana plasmática esté expuesta a los fluidos extracelulares, puede ser neutralizada por anticuerpos antitóxicos, pero una vez internalizada en la neurona no es más accesible a los anticuerpos. Esto limita el período de eficacia de la inmunoterapia en el tratamiento del botulismo a pocas horas luego de la entrada de la toxina al organismo, excepto en el botulismo del lactante donde la producción de toxina es quizá continua en el intestino.

Las toxinas botulínicas son metaloproteinasas que unen un ión Zn2+ (zinc-endopeptidasas). La acción de las toxinas, es altamente específica hidrolizando tres proteínas que componen el aparato que media la liberación del neurotransmisor en la sinapsis terminal. El núcleo de este aparato está compuesto por la proteína de la membrana asociada a la vesícula (VAMP o sinaptobrevina) y dos proteínas de la superficie citosólica de la membrana presináptica: proteína de la membrana asociada al sinaptosoma (SNAP-25) y sintaxina. Estas tres proteínas forman un complejo heterotrimérico que sirve de soporte para el ensamble del aparato que media la liberación del neurotransmisor. Las toxinas A y E hidrolizan la SNAP-25, mientras que las B, D, F y G hidrolizan la VAMP y la C la SNAP-25 y la sintaxina. Las distintas toxinas actúan a nivel de diferentes uniones peptídicas e inhiben la exocitosis de la acetilcolina y producen muerte de las células neuronales en cultivo. La toxina tetánica hidroliza la VAMP, produciendo experimentalmente signos periféricos en el ratón, inoculado por vía IP con dosis elevadas de toxina tetánica, idénticos e indistiguibles de los signos producidos por la toxina botulínica (Figuras 1 y 2).

El sitio primario de acción es la unión neuromuscular, afectando las inervaciones colinérgicas, produciendo bloqueo presináptico de la liberación de transmisores y parálisis fláccida general. Otros sitios colinérgicos afectados son las sinapsis ganglionares y las fibras posganglionares parasimpáticas. El SNC y troncos nerviosos no son afectados directamente. Actúa a nivel presináptico, bloqueando la liberación de acetilcolina, sin afectar su síntesis ni metabolismo.

Aspectos clínicos

La signosintomatología es conse­cuencia de los efectos periféricos de la toxina con selectividad por las estructuras colinérgicas. El bloqueo neuromuscular es permanente y la función sólo se recupera cuando se forma una nueva placa mioneural por brotación del nervio motor que puede to­mar de 2-3 semanas hasta 6-9 meses.

En los casos de intoxicación alimentaria, el período de incubación o de latencia se extiende desde el momento de la ingestión de la toxina con el alimento hasta la aparición de los primeros síntomas, pudiendo oscilar entre pocas horas a varios días, siendo el promedio de 12 a 36 h, dependiendo de la cantidad y tipo de toxina ingerida. Los primeros síntomas pueden ser náuseas y vómitos, pero, los trastornos que con frecuencia pueden llamar pri­mero la atención son ­las alteraciones oculares como visión borrosa, fotofobia, diplopía, reflejo fotomotor débil o midriasis y blefaropto­sis, además, somnolencia, disfa­gia, disfonía y disartria. En el período de estado se produce disminución de la secreción salival con marcada sequedad de la mucosa bucal, lengua y faringe (xerostomía); dificultades en la deglución y constipación; hipotonía, adinamia y astenia con disminución o abolición de los reflejos osteo­tendinosos. El compromiso de los músculos respiratorios (intercostales y diafragma) ocasiona disnea y sig­nos de insuficiencia respiratoria, pudiendo conducir a la muerte por apnea, aunque a veces puede deberse a arritmias cardíacas. El cuadro transcurre sin fiebre, cuando se pre­senta, se debe a complicaciones por sobreinfección (generalmente neumonía por aspira­ción). La probabilidad de sobrevida depende, fundamentalmente, del diagnóstico y te­rapia especifica precoces y del apoyo en unidades de cuidados inten­sivos. En caso de recuperación, ésta suele ser lenta pero sin dejar secuelas (Libonatti, E. J. y Tchoulamjan, A., 1971).

El botulismo por herida se presenta con una patogenia similar a la del tétanos. Resulta de la producción in vivo de toxina botulínica luego de la contaminación con esporas y colonización en tejidos dañados de una he­rida típicamente traumática y contaminada con suelo. Luego de su germinación y desarrollo in situ, el clostridio ela­bora la toxina botulínica que es incorporada a la circulación. Es importante destacar la descripción de cuadros clínicos post-operatorios (Morbid. Mortal. Wkly. Rep. 28 NE7, 1979) y el aislamiento de C. bo­tulinum a partir de catgut (Merson, H.M. and Dowell, B.R., 1973). Las características epidemiológicas sugieren que ocurre con mayor frecuencia desde la primavera hasta el otoño afectando predominantemente hombres jóvenes con una distri­bución en adultos similar a la encontrada para el tétanos antes del uso del toxoi­de. La mayor prevalencia en hombres jóvenes puede reflejar su mayor participación en actividades al aire libre y por lo tanto mayor exposición al suelo. En cuanto al cuadro clínico, los hallazgos neurológicos son idénticos a los observados en el botulismo por ali­mentos, sin embargo, no se observan síntomas gastrointestinales y en contraste con éste, puede presentarse fiebre secundaria a la infección. El período de incubación varía de 4 a 14 días. Es más largo que en el botulismo por alimentos y está posiblemente asociado con el tiempo requerido para la multiplicación del microorganismo y liberación de toxina en la herida. Los rasgos clí­nicos que pueden considerarse espe­cíficos del botulismo por herida son por ejemplo, fiebre y alteraciones sensoriales unilaterales.

El botulismo del lactante, afecta a niños menores de 1 año, con mayor incidencia entre 3 y 20 semanas de edad. El cuadro clínico puede variar desde una parálisis leve a moderada hasta una forma fulminante, indistinguible del denominado síndrome de muerte súbita infantil, que se diagnostica por autopsia (Arnon, S.S., 1980).

El período de incubación no se conoce. Las manifestaciones clínicas pueden presentarse dentro de un amplio espectro que com­prende desde manifestaciones leves hasta insuficiencia respiratoria grave que ocasiona el ingreso a unidades de cuidados intensivos para apoyo ventilatorio mecánico. Se describe como triada orientadora la constituida por: hipotonía, constipación y reflejo fotomotor lento o perezoso (Lentini, E. y col., 1984).

La hipotonía con disminución de la fuerza muscular suelen constituir el motivo de consulta. Comienza con disminución de la motilidad espontánea de las extremidades y pérdida de sostén cefálico, progresando hacia una parálisis fláccida generalizada que en ocasiones compromete la musculatura respiratoria, lo que lleva a insuficiencia respiratoria por hipoventilación alveolar y a la necesidad de asistencia respiratoria mecánica. Los reflejos osteotendinosos profundos se encuentran disminuidos o abolidos. La constipación (3 o más días sin defecación) precede a la hipotonía en varios días. Las alteraciones de los pares craneales se manifiestan por reflejo fotomotor lento, otalmoplegía externa, estrabismo, ptosis palpebral, llanto ronco o débil, disminución del reflejo de succión y deglución, disminución del reflejo nauseoso y del reflejo tusígeno con posibilidad de broncoaspiración y neumonía secundaria. Por la disfunción autonómica pueden presentar retención urinaria, disminución de lagrimeo y salivación, taquicardia-bradicardia, hipotensión-hipertensión. La hipotonía, ptosis palpebral y estrabismo demoran meses en desaparecer. Las complicaciones que pueden presentarse son, broncoaspiración, neumonías, síndrome de distress respiratorio, variaciones bruscas de frecuencia cardíaca y tensión arterial y paro cardíaco, entre otras (Blaustein, A., 1999).

La evolución del paciente hospitali­zado es variable. En general la debilidad aumenta después de la admisión, alcanzando un máximo en 1-2 semanas. Permanece en ese nivel unas 2-3 sema­nas antes de evidenciar recuperación de la fuerza y del movi­miento. Luego, la mejoría es muy lenta pero constante, a menos que se presenten complicaciones.

Para determinar la verdadera inci­dencia es necesario: (1) que el conocimiento de la enferme­dad tenga una amplia difusión (para mejorar y aumen­tar su sospecha y de­tección) y (2) el acceso a laboratorios especia­lizados de diagnóstico para su confir­mación.

En cuanto al botulismo críptico, su diagnóstico merece consideración en aquellos pacientes mayores de 1 año con signos y síntomas de botulismo en los que no se puede implicar un alimento específico como vehículo ni demostrar la pre­sencia de heridas infectadas.

Metodología diagnóstica específica

La sospecha clínica y epidemiológica debe ser confirmada por exámenes de laboratorio mediante investigación de C. botulinum y su toxina. Los estudios electromiográficos pueden ser de utilidad, sobre todo cuando los trastornos neurológicos demoran en aparecer (Merson, H. M., and Dowell, B. R., 1973).

1. Muestras

1.1. Investigación de C. botulinum: En el botulismo por alimentos se realiza (1) en muestras ­de contenido intestinal (deposición espontánea o enema) y vómitos o contenido gástrico obtenido por sondeo, de todos los comen­sa­les sin excepción, con o sin cuadro clínico y (2) en ali­mentos. En el botulismo del lactante y el críptico, se realiza en contenido intestinal; la sola de­mos­tración de C. botulinum en el intestino ­de un lactante con algún signo compatible certifica el diagnós­tico. En el botulismo por herida, en tejido o exudado de la herida, obtenidos preferiblemente, aunque sea pequeña, por drenado quirúrgico (Merson, H. M., and Dowell, B. R., 1973). Esta determinación tiene limitaciones ya que si no hay síntomas de botulismo, el aislamiento de C. botulinum de la herida no se considera diagnóstico.

1.2. Identificación de toxina: se realiza demostrando la presencia de sustancia tóxica para el ratón, termolábil, neutralizable por antitoxina botulínica. Se debe investigar en todos los materiales antes citados y además en suero sanguíneo. Es indispensable extraer la sangre antes de iniciar terapia específica con suero antibotulínico.

En el botulismo del lactante, la detección de toxina es casi invaria­blemente positiva en materia fecal pero poco frecuente en suero, no obstante su identificación confirma por sí sola el diagnóstico. En EE.UU., debido a la baja frecuencia de detección ha sido considerada de poco valor, sin embargo, la alta frecuencia de resultados positivos en Mendoza (60%), utilizando una metodología que incrementa la sensibilidad del método, sugiere que la prueba es de utilidad (Hatheway, Ch. L., and McCroskey L., 1987; Fernández, R. A. y col., 1995).

En el botulismo por herida, la toxina circulante ha sido detectada en menos del 50% de los ca­sos. Dezfulian y Bartlett (1985) demostraron presencia de to­xina botulínica en tejidos de la herida infectada y sugirieron que su identificación en el exudado o tejidos de la misma pue­de permitir un diagnóstico precoz de laboratorio y una terapia específica más efectiva, aun después de la aparición de los síntomas.

3.2. Metodología

3.2.1. Investigación de toxina: (1) en lavado gástrico o enema: en el sobrenadante del centrifugado (12.000 xg, 20 min, 4 1C); (2) en heces: en el centrifugado del extracto obtenido triturando 10-40 g con igual cantidad (P/V) de diluyente de gelatina (gelatina 0,2% en solu­ción tampón de fosfatos 0,1 M, pH 6,5), que se deja reposar 12-18 h a 41C y (3) en alimentos: es conveniente homogeneizar y cen­trifugar todo el alimento (o por lo menos 2 a 3 muestras de distintas partes) diluido adecuadamente con diluyente de gelatina, de acuerdo a su consistencia o a la presencia o no de una fase líquida.

La prueba se realiza inoculando por duplicado 0,5 ml del sobrenadante de los centrifu­ga­dos por vía IP en ratones. Para la neutralización, se inyecta a cada ratón 0,5 ml de una mezcla, previamente mantenida 1 h a 37 1C, de 0,5 ml de los sobrenadantes ­y 0,5 ml de antitoxina ­­­polivalente (incluyendo 1.000 a-DL50 de cada tipo de los más frecuentes en la región: ABFG en Argentina) (Fernández, R. A., 1994). Los animales son observados hasta 96 h. Cuando se detecta presencia de sus­tan­cia tóxica neutralizable con la antitoxina polivalente se deben ensayar las antitoxinas específicas indivi­dualmente. Ade­más, se deben inocular ratones con 0,5 ml de los extractos calentados 10 minutos a 100 1C (excepto el suero sanguíneo) y con 0,5 ml de extracto tripsinizado (9 partes de extracto más 1 parte de tripsina 1:250 al 1% incu­bado 30 min a 37 1C), para facilitar la detección de toxinas de cepas no proteolíticas que producen bajos niveles de toxina activa.

En cuanto al suero de los pacientes, debido a que normalmente se detectan bajas concentraciones de toxina (generalmente no más de 50 DL50 ratón IP/ml), es aconsejable disponer de por lo menos unos 5 ml de suero. La prueba debe realizarse por duplicado, inyectando 1,0 ml a cada uno de 2 ratones. La neutralización preliminar se realiza inyectando a cada ratón 1,1 ml de una mezcla de 2,3 ml de suero con 0,23 ml de antitoxina polivalente, incubada 30 min a 37 1C.

3.2.2. Investigación de Clostridium botulinum

Se realiza resuspendiendo los sedimentos de los cen­trifu­gados para la prueba de toxicidad con diluyente de gelatina y sembrando dos alícuotas en sendos frascos Erlenmeyer con medio de carne picada. Uno se calienta para la selección de espora (10 minutos a 80 1C). A partir de las 24-72 h y hasta los 10 días de incu­bación a 31 1C se inicia el ensayo de toxina en los sobrenadantes de los cultivos centrifugados. En los caldos positivos se aborda el aislamiento del agente en medios sólidos.

Para la tipificación serológica definitiva la cepa aislada se cultiva por el mé­todo de diálisis (Sterne, M. and Wentzal, L. M., 1950) para obtener alta concentración de toxina y la neutralización se realiza a altos niveles de toxina, no menos de 1.000 (hasta 10.000) DL50/ratón, para identificar fracciones heterólogas menores presentes en baja proporción (1% o me­nos) (Giménez, D. F., 1976).

Tratamiento recomendado

Actualmente la terapia de apoyo es el único tratamiento indiscutiblemente eficaz. Muchos pacientes morirían si no fueran colocados en un respirador. La administración de anticuerpos, aunque ampliamente utilizados en el botulismo por alimentos, es de un valor cuestionable. Esta aseveración quizá sea correcta para los tipos B y F y posiblemente el E, pero no para el tipo A cuya toxina ha demostrado producir en el hombre una enfermedad más grave y de alta letalidad y el tratamiento antitó­xico debe ser considerado indispensable (Middlebrook, J. L., and Dorland, R. B., 1984).

De cualquier manera, en nuestro medio con: (1) elevada prevalencia de C. botulinum toxigénico en el suelo, (2) la gran diversidad de serotipos con alta dominancia del serotipo A (Fernández, R. A., 1994), (3) la alta toxigenicidad exhibida por este serotipo, (4) la gravedad de los signos y síntomas que produce y (5) el consumo des­proporcionado que exhiben algunas toxinas tipo A en las pruebas de neutralización con antitoxinas de uso corriente en terapéutica (hasta 6 u 8 veces más que con la antitoxina elaborada con la cepa ho­móloga), debe preconizarse el uso de antitoxina (Ciccarelli, A.S.; Giménez, D.F., 1971). Debería incluir los tipos ABE y quizá F, a fin de cubrir­ por lo menos la even­tualidad de una into­xica­ción por tipo F o Af que, aunque menos frecuentes que la producida por los tipos A y B, podría ser causa de fracaso en el tra­ta­miento­­.

La quimioterapia con distintos agentes como gua­nidina y aminopiridinas se ha intentado con resultados inciertos (Werner S.B. et al., 1979; Kaplan J.E. et al., 1979; Molgó J. et al., 1987; Siegel L.S. et al., 1986).

En el botulismo por herida se recomienda: debri­dación local, antitoxina y antibióticos (Merson, H.M. and Dowell, B.R., 1973).

En cuanto al botulismo del lactante, es de pri­mordial importancia su admisión a una unidad de terapia in­tensiva y acceso a la ventilación mecánica. El uso de laxantes, enemas y antibióticos aun no está bien determinado y es motivo de discusión. El éxito en el manejo depende de aplicar una terapia de apoyo meticulosa y evitar potenciales complicaciones fatales, requiriendo generalmente la máxima atención la alimentación y la respiración. Aun en ausencia de la necesidad de utilización de respiración mecánica, es conveniente generalmente realizar intubación endotraqueal para proteger la vía respiratoria. Para la alimentación es conveniente instalar una sonda nasogástrica o nasoyeyunal siendo la leche materna el líquido nutricional de elección. En cuanto a la utilización de antitoxina, la experiencia es limitada y al parecer no sería indispensable para la recuperación de los pacientes. Cuando la detección de toxina ­en suero del paciente es negativa, su administración es desalentada, pero habría que considerar que aunque la toxina puede ser absorbida del tracto intestinal en forma intermi­tente o en cantida­des no detectables por las pruebas utili­zadas corrientemente, como necesariamente debe ser vehiculizada por vía sanguínea, cabría igualmente su utilización. Actualmente en EE.UU. se dispone de un derivado humano de antitoxina botulínica denominado BIG (botulism immune globulin). En un estudio de 5 años realizado en California, se demostró la eficacia y seguridad de este derivado. El uso de BIG redujo la media de la estadía hospitalaria por caso de aproximadamente 5,5 semanas a 2,5 semanas (p<0,001) y redujo la media del costo de hospitalización de más de U$S 88.000 a aproximadamente U$S 70.000 (p<0,001) (Arnon, S. S., 1998).

Medidas de prevención y control

La administración del toxoide (vacuna) en forma extensiva no está justi­ficada debido al número limitado de exposiciones por año a la toxina (botulismo por alimentos y por herida) (Middlebrook, J.L., 1986). En cambio, teniendo en cuenta la alta fre­cuencia que debe exhibir el botulismo del lactante,­ hoy segu­ramente subeva­luada en nuestro país y en otras partes del mundo, merecería discusión la consideración de la protección de los lactantes iniciando la inmunización activa en los últimos meses de gesta­ción al igual que en el té­tanos (Fernández, R. A., 1994).

La mejor manera de reducir al mínimo los riesgos de into­xicación botulínica por alimentos es optimizando la acción pre­ventiva mediante­: (1) optimización de los procedi­mientos tecnológicos en la elaboración industrial; (2) ­­ma­yores y más enérgicas medidas en los controles de calidad; y (3) utilización de normas de elaboración en el envasado hogareño para evitar -o por lo menos disminuir- los riesgos del desa­rro­llo de C. botuli­num (higiene, pH, aw, tratamiento térmico, etc.).

No obstante, antes de consumir cualquier alimento envasado (casero o in­dustrial) debe tomarse la precaución ­de calentar en baño de agua hirviente, durante no menos de 30 minutos (para recipientes de no más de 1 kg de capacidad), todo envase (lata o frasco) antes del consumo, para inac­tivar la toxina que es termolábil. No es con­veniente exceptuar aquellos alimentos ­que in­tegrarán platos que durante su prepa­ración se sometan­ a cocción ya que la ingestión accidental o contacto con mucosas, de pequeñas proyecciones del contenido al abrir y/o vaciar el envase, podría ser mortal.

La prevención del botulismo por herida estaría asentada, al igual que en el té­ta­nos fundamentalmente en la higiene de la herida, ya que tampo­co se utiliza el toxoide por las mismas consideraciones que en el botulismo por alimentos.

En cuanto al botulismo del lactante, en EE.UU. el CDC y el Departamento de Salud de California, han recomendado que los niños menores de 1 año no sean alimentados con miel (Arnon, S. S., 1980), advertencia que quizá sea conveniente hacer extensiva a nuestro medio ya que en algunas muestras se identificó C. botulinum (Nakano, O. et al., 1990; Centorbi, O.P. y col., 1994; Fernández, R.A. y col., 1994; Monetto, A. M., et al., 1999; Rosetti, F., et al., 1999).

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Tipo Especies afectadas Vehículos comunes Mayor incidencia geográfica

A hombre, aves alimentos envasados, carnes Oeste de EE.UU., Ucrania,

y conservas de pescados Argentina

B hombre, equinos, carnes, forrajes Europa, este de EE.UU.,

bovinos Argentina

C aves, bovinos, vegetación acuática, América del Norte, Europa,

equinos, caninos forrajes Sudáfrica, Australia, Uruguay,

Argentina

D bovinos carroña Sudáfrica, Australia, Argentina

E hombre productos de mar Europa, Asia, América del Norte

F hombre pasta de hígado, pepinillos Dinamarca, EE.UU., Argentina

G )hombre? suelo Argentina

autopsia Suiza

Ab hombre pastel de conejo Francia

Af hombre escabeche de pescado Argentina

Ba botulismo del lactante EE.UU.

Bf botulismo del lactante EE.UU.

Botulismo Año

1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996

Lactante 88 86 78 74 74 93 74 60 86 81 82

Alimentos 24 20 45 23 26 24 16 22 42 21 22

Herida 3 3 2 4 4 3 3 4 11 2517

TOTAL 115 109 125 101 104 120 93 86 139 127 121

Autorizado por Susan E. Maslanka, Ph. D. Chief, National Botulism Surveillance and Reference Laboratory, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA.

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